「文献解读」用于分析神经肌肉接头和突触的超分辨率显微镜!超透镜技术状况报告?

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01—研究背景超分辨率显微镜技术提供了亚衍射极限的分辨率,与传统的共焦显微镜相比,分辨率提高了2到10倍。光学显微镜分辨率的这一突破为神经科学和突触生物学的新发现做出了贡献。本文综述了结构照明显微镜(SIM)、受激发射损耗显微镜(STED)和随机光学重构显微镜(STORM)/单分子定位显微镜(SMLM)技术,并对它们进行了比较,以更好地理解它们之间的差异及其在

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01

研究背景

分辨率显微镜技术提供了亚衍射极限的分辨率,与传统的共焦显微镜相比,分辨率提高了2到10倍。光学显微镜分辨率的这一突破为神经科学突触生物学的新发现做出了贡献。本文综述了结构照明显微镜(SIM)、受激发射损耗显微镜(STED)和随机光学重构显微镜(STORM)/单分子定位显微镜(SMLM)技术,并对它们进行了比较,以更好地理解它们之间的差异及其在突触生物学分析中的适用性。本文还就这些显微技术的实用层面进行了讨论,包括分辨率、图像采集速度、多色能力及其他优缺点。此外,本文还总结了超分辨率显微镜如何用于分析神经肌肉接头和突触的方法。

神经肌肉接头 (NMJ) 是在运动神经元和肌肉纤维之间形成的大型突触。由于它们的大尺寸和可访问性,这些突触已经被研究人员们使用组织学生理学的方法进行了非常广泛的研究。即使针对这些突触的研究历史已经非常悠久了,但近来超分辨率显微镜的出现和投入使用,还是使得这类研究有了新的发现。

02

研究介绍(节选)

一、SIM、STED 和 STORM 超分辨率显微镜的优缺点

1、分辨率

超分辨率显微镜提供亚衍射极限分辨率,优于约 200 nm 的共聚焦显微镜的分辨率。在神经生物学中,共聚焦显微镜可以对轴突和神经、树突树状形态、线粒体形态、细胞核、突触和 NMJ 进行成像。然而,超分辨率显微镜可用于对棘的详细结构、Ranvier 节点中的蛋白质分布模式、核孔蛋白质、突触前和突触后蛋白质的亚突触定位以及突触囊泡进行成像。

以NMJ为例,NMJ的正面视图很大,尺寸范围约为 10 – 60 μm(人类、小鼠); 然而,这种突触的一些关键特征的尺寸低于 200 nm 的衍射极限分辨率。例如,突触囊泡为 55 nm,活动区为 50 – 100 nm,突触间隙为 50 – 100 nm;此外,结折峰宽度为 207 nm,开口宽度为 55 nm (图1),层粘连蛋白长度为 77 nm,Lrp4 蛋白长度约为 60 nm。因此,分析这些特征需要提高超分辨率显微镜的分辨率。

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图1、阿贝的衍射极限,突触结构的大小以及用于超分辨率显微镜的工具

这三种技术的 XY 平面分辨率如下:SIM,120 nm,STED 和 STORM,20 – 30 nm (表1)。与共聚焦显微镜相比,它们的分辨率显着提高,共聚焦显微镜在 XY 平面上的分辨率约为 200 nm,沿 Z 轴的分辨率约为 500 nm(对于使用 NA=1.4 透镜观察到的绿色荧光染料)。因为焦区较宽,共聚焦显微镜的 Z 轴分辨率低于 XY 分辨率。超分辨率显微镜技术的 Z 轴分辨率如下:SIM,300 nm,STED,75 – 100 nm(Easy 3D,STED 3×)和 STORM,50 nm(STORM 3D)。

除了分辨率的差异之外,这三种技术在提高分辨率的机制上也有所不同。SIM 和 STORM 基于原始数据显微照片的后处理来重建超分辨率图像,STED 显微镜使用应用于原始数据显微照片的傅里叶变换生成超分辨率图像。STED 显微镜通过在样品上扫描激光束来生成超分辨率图像,类似于共聚焦显微镜。STORM 通过收集数千张显微照片并使用高斯分布近似和分配点来重建它们,类似于点画法,从而生成超分辨率图像。

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表1、超分辨率显微镜规格比较

2、颜色数

与传统的荧光显微镜技术类似,超分辨率显微镜可以使用多种颜色进行。SIM 的图像构建依赖于对 9 到 15 个采集到的具有莫尔条纹的图像进行后处理;因此,如果激发和发射波长在荧光团之间分离,则可以进行多色成像。

在 STED 显微镜中,通过用激发激光扫描样品并获取每个荧光团的发射波长来生成类似于共聚焦显微镜的图像。与共聚焦显微镜的区别在于需要将荧光团的发射波长与 STED 激光的波长相匹配,以将激发的荧光团耗尽至基态。

STORM 需要高强度光下在非发射状态和基态之间切换的荧光团,以及用于这些切换荧光团的专用缓冲环境。荧光团随机弛豫到基态,然后被激发发射荧光。具有这些特性的荧光团称为光可切换(光闪烁)染料(对于 STORM)和可光切换荧光蛋白(对于 PALM)。dSTORM 或无激活剂 STORM方法允许使用与二抗偶联的市售光可切换染料,而无需激活剂-报告剂对染料,这有利于多色分析。三色 STORM 分析通过将 STORM 与光谱分离(光谱解混)方法相结合,来解析具有重叠发射光谱的荧光团。

3、成像速度和实时成像

商用 SIM 显微镜的时间分辨率与 STED 显微镜相似,优于 STORM,因为 SIM 重建超分辨率图像所需的原始显微照片数量仅为 9 到 15 张,而 STORM 则需要数万张。此外,与 STED 和 STORM 相比,SIM 需要较低的成像光强度。SIM 实时成像目前用于分析各种神经系统结构,包括培养神经元的生长锥、生长锥细胞骨架和囊泡、培养的海马神经元的树突棘,以及大脑中的树突和树突棘,活斑马鱼幼虫或活老鼠。

STED 显微镜类似于共聚焦显微镜,两者都是扫描显微镜。点扫描显微镜允许对较小的区域或线进行成像,以提高时间分辨率,而不是扫描整个视野。STED显微镜实现了视频速率的快速实时成像;例如38.5 FPS用于分析囊泡融合和内吞作用,28 FPS用于分析神经元中的突触蛋白 。

STORM (PALM, SMLM) 成像速度约为 0.1 FPS,因为需要数万帧(显微照片)来重建超分辨率图像,比 SIM 和 STED 的时间分辨率低。目前,已经开发了多种算法来提高STORM的时间分辨率,包括识别可能具有重叠点扩散函数的分子位置的多发射体拟合算法。STORM 已与 TIRF 显微镜相结合,因此具有低于 1 微米的浅成像深度,使用 STORM 可以对几微米到 30 微米厚的切片进行成像。

目前各种超分辨率显微技术基本都可以实现商用,但是每种技术都有优缺点,在选择用于项目的方法之前,需要综合考虑。例如,如果项目需要最高分辨率,STORM 和 STED 可以提供目前商用超分辨率显微镜(横向分辨率为 20 至 30 nm)的最佳分辨率。如果项目需要蛋白质数量信息,STORM 已被证明可以提供定量信息。

二、超分辨率显微镜类型对突触分析的适用性

1、用于 NMJ 分析的 SIM

三维结构照明显微镜 3D-SIM已用于分析大衔接蛋白 Ankyrin2-L通过调节突触前微管和细胞粘附分子在稳定果蝇幼虫 NMJ 中的作用。3D-SIM 揭示了一个重复的晶格结构,其周期性约为 200 nm,由轴突中的 Ankyrin2-L 和 β-spectrin 组成,但在突触前 boutons 中的组织结构较差。

通过在小鼠 NMJ 中使用 3D-SIM,分析突触蛋白的分布模式,包括突触前活性区蛋白 Piccolo 和突触后蛋白 rapsyn、电压门控钠通道和整合素 α7,相对于突触后连接折叠的分布模式进行了分析。与之前的报道一致,这些蛋白质是在 NMJ 的预期位置观察到的。

2、用于 NMJ 分析的 STED 显微镜

超分辨率显微镜在 NMJ 分析中的首次应用是使用 STED 显微镜对果蝇NMJ 的活动区进行成像。活动区是突触前膜上的突触囊泡释放位点。活动区域在电子显微镜图像中显示为果蝇NMJ 中的 T 条或脊椎动物 NMJ 中的小聚集体。先前通过共聚焦显微镜显示该蛋白质在运动神经末梢以点状分布,每个泪点内没有任何明显结构。STED 显微镜的亚衍射极限分辨率首次揭示了每个泪点内的结构,并阐明了每个泪点中 Bruchpilot 蛋白的环状模式。

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表2、用于 NMJ 分析的超分辨率显微镜技术

3、STORM 用于 NMJ 分析

与 STED 显微镜类似,STORM 最初用于分析果蝇幼虫 NMJ。使用直接随机光学重建显微镜 (dSTORM) 定量分析果蝇幼虫 NMJ 的活动区。作为单分子定位显微镜方法,dSTORM 用于定量内源性蛋白质。活性区特异性 Bruchpilot 蛋白的数量估计为每个活性区 137 个蛋白质,这些蛋白质的四分之三被组织成大约 15 个不同的位置,每个位置有 7 个 Bruchpilot 蛋白。这种定量 dSTORM 技术成功地显示了 Rab3 突变幼虫 NMJ 中每个活性区的 Bruchpilot 蛋白数量增加了大约 60%。此外,STORM 被用来分析 Bruchpilot 和 synaptotagmin 在快速谷氨酸释放中的作用以及 Bruchpilot 和络合蛋白在将突触囊泡束缚到果蝇的活跃区中的作用幼虫 NMJ。

在小鼠 NMJs中,基于 STORM 图像,作者提出了一种新的乙酰胆碱受体分布模式,其中受体浓度在交界褶口的肩部较高,但在脊部较低。这种分布模式与经典理解略有不同,其中乙酰胆碱受体被认为分布在交界褶皱脊的顶部和肩部,而不是褶皱的底部。

作者使用 STORM 比较了人和小鼠 NMJ 以分析突触体相关蛋白 25 (SNAP25) 的分布模式。在小鼠 NMJs 中,SNAP25 以点状方式分布,其密度(每 μm 2 15 )类似于活性区蛋白 Bassoon 和 Piccolo 的点状密度(每 μm 10 2)。有趣的是,与小鼠 NMJ 相比,人类 NMJ 在泪点大小、每个 NMJ 区域的泪点密度和免疫组织化学的信号强度方面显示出更大的 SNAP25 值。基于这些发现,作者提出人类和小鼠 NMJ 之间存在差异。

03

研究结论

果蝇 NMJ 的超分辨率显微镜研究已经取得了长足的进步,并揭示了令人印象深刻的纳米结构和以前在电子显微照片中被称为 T 型条的活性区的分子特性。良好的分子标记(例如,活跃区的 Bruchpilot)和丰富的遗传突变资源的结合为使用超分辨率显微镜研究果蝇 NMJ 生理修饰的分子机制提供了丰富的机会。哺乳动物 NMJ 的超分辨率显微镜研究仍处于起步阶段。据我们所知,这些超分辨率方法尚未用于脊椎动物 NMJ 的实时成像。然而,已经使用电子显微镜断层扫描在青蛙和小鼠中研究了脊椎动物 NMJ,揭示了突触前活动区的超微结构细节。超分辨率显微镜提供了揭示这些建模结构的分子身份的机会,以便更好地了解脊椎动物突触,超分辨率显微镜的发展提高了对支撑分子机制的理解。

04

超高分辨率显微成像系统

iSTORM

前文中提及的随机光学重构显微镜(STORM)技术,目前已成功实现商用。超高分辨率显微成像系统 iSTORM,成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破,使得在 20 nm的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及超分子结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实,从而给生命科学、医学等领域带来重大性突破。

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图2、超高分辨率显微成像系统iSTORM。

超高分辨率显微成像系统 iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同时成像、3D同步拍摄、实时重构、2小时新手掌握等特点,已实现活细胞单分子定位与计数,并提供荧光染料选择、样本制备、成像服务与实验方案整体解决方案,以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性,获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。

参考文献:

Badawi Y, Nishimune H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neurosci Lett. 2020 Jan 10;715:134644. doi: 10.1016/j.neulet.2019.134644. Epub 2019 Nov 22. PMID: 31765730; PMCID: PMC6937598.

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